زمینه و هدف: یکی از اقسام پژوهش ها و اقدامات در زمینه ژن انسانی، ویرایش ژن به قصد درمان بیماری است. متخصصان با کشف فناوری نوین تحت عنوان «کریسپرکس 9» یا ویرایشگر ژن، این توانایی را ایجاد نمودند که با حذف یا ویرایش ژن های نامطلوب و بیماری زا در بدن، مبادرت به درمان ورزند و زندگی بیمار را احیا نمایند. از آنجا که منشا بسیاری از بیماری های انسان ژنتیک است؛ لذا پژوهش پیرامون حکم فقهی ابزاری که توانایی اصلاح ژن را به عهده دارد ضرورتی اجتناب ناپذیر است. این نوشتار با هدف بررسی حکم فقهی ویرایش ژنوم با مقاصد درمانی، اقوال فقیهان موافق و مخالف را مورد واکاوی قرار داده و دیدگاه معتدلی ارایه می دهد. مواد و روش ها: مطالب پژوهش حاضر با روش توصیفی تحلیلی و مراجعه به منابع کتابخانه ای از طریق فیش برداری سامان یافته است. نتیجه گیری: حکم فقهی استفاده از فناوری ویرایشگر ژنوم مورد اختلاف فقیهان است. نگارندگان با امعان نظر در ادله به این نتیجه دست یافته اندکه تغییرات لازم در ژنوم انسان با انگیزه درمان تا جایی که موجبات ارتقای جسمی و روحی او را فراهم کند و ضرر و نقصان قابل توجهی نداشته باشد هیچ مغایرتی با خلقت الهی ندارد و حکم جواز آن با استناد به ادله ای چون اصل اباحه، وجوب تداوی و حفظ نفس، قاعده تسلیط، عروض عناوین ثانوی و ترغیب دین به تسخیر و کشف سنن الهی توجیه پذیر است.

1سیستم­های کریسپر یا تکرارهای کوتاه پالیندرومی فاصله­دار منظم خوشه­ای و پروتئین­های مرتبط با آن، سیستم­های ایمنی طبیعی میکروبی­ هستند که به عنوان وسیله­ای برای ویرایش ژنی مورد استفاده قرار گرفته­اند. برای ایجاد اثرهای درمانی، اجزای کریسپر باید به طور مستقیم به سلول­های هدف منتقل شود. روش­های متفاوتی برای انتقال وجود دارد. در این مطالعه به برخی سیستم­های انتقال از طریق غشای سلول، شامل سیستم­های انتقال ویروسی و غیر ویروسی پرداخته شده است. سیستم انتقال ویروسی، استفاده از ویروس­هایی مانند وکتور ویروس وابسته به آدنو است ولی نگرانی­هایی در استفاده­ بالینی آن وجود دارد. در روش انتقال فیزیکی دوز، مدت زمان و اختصاصیت انتقال دقیق­تر کنترل می­شود که شامل روش­های الکتروپوراسیون، تزریق هیدرودینامیکی و میکرواینجکشن می­باشد. در روش­ الکتروپوراسیون ممکن است تغییرهای غیرقابل برگشت در فیزیولوژی غشا ایجاد شود که زنده­مانی سلول را تهدید می­کند. در تزریق هیدرودینامیکی حجم لازم برای شروع تزریق زیاد است و روش مناسبی برای کاربردهای انسانی نیست. میکرواینجکشن دارای کارایی بالا و دوز دقیق کنترل شده است ولی برای کاربرد زیاد غیر عملی است. اگرچه رویکرد­­­­­های فیزیکی به طور معمول در محیط آزمایشگاه بسیار موفق هستند، اما به طور کلی مقیاس خوبی ندارند و بنابراین برای انتقال در شرایط زنده یا برنامه­های با ظرفیت بالا در آزمایشگاه کمتر کاربرد دارد. در روش­های انتقال شیمیایی، به جای القای تغییر در سلول هدف، خود محموله قابل انتقال می­تواند تغییر یابد. انتقال شیمیایی به دو شکل شامل روش کپسوله­سازی و روش تغییر شیمیایی ماده­ انتقال پذیر وجود دارد. کپسوله­سازی می­تواند محموله را از تخریب آنزیمی یا پاسخ­های ایمنی محافظت کند و اختصاصی بودن انتقال را ارتقا بخشد. انتقال با تغییر ماده انتقال پذیر، محافظت در مقابل تخریب توسط پروتئازها را تامین نمی­کند، همچنین قادر به هدف­گیری خاص سلول نیستند. بنابراین استفاده موفقیت آمیز نیاز به ترکیب با روش کپسوله­سازی یا سایر روش­های انتقال دارد. با توجه به این که هر کدام از روش­های انتقال دارای عیب­ها و مزیت­هایی هستند، لازم است موثرترین روش انتقال انتخاب شود، تا سیستم کریسپر برای ویرایش ژن کارآمد باشد.

اصلاح هدفمند ژنومی با استفاده از نوکلئازهای هدایت شونده توسط RNA روشی سریع، آسان و پربازده است که نه تنها امکان دستکاری و تغییر ژن ها و مطالعات کارکردی را برای پژوهشگران فراهم نموده است، بلکه آگاهی آن ها را در رابطه با اساس مولکولی بیماری ها و ابداع روش های درمانی نوین و هدفمند افزایش داده است. تاکنون فنون متفاوتی با عنوان قیچی های مولکولی با قابلیت ویرایش هدفمند ژنوم شاملZFN، TALEN وCRISPR/Cas9 ایجاد شده است. در واقع CRISPR/Cas9، سیستم ایمنی باکتری ها در برابر ویروس ها است که در آن نوکلئاز Cas9 توسط یک RNAی راهنمای تک رشته به توالی های مکمل هدف متصل شده و تغییراتی را اِعمال می کند. پیشرفت های حاصل شده در انتقال، ترمیم و پیدایش راهکار های ویژه موجب ابداع رده های متفاوت CRISPR/Cas9 شده است. از آن جایی که این ابزار تنومند، قادر به اصلاح مستقیم جهش های عامل بیماری است، توانایی آن در درمان اختلالات ژنتیکی مورد توجه فوق العاده ی پژوهش گران قرار گرفته است. با توجه به موارد گزارش شده از هدف گیری های غیر اختصاصی پروتئین Cas9، تمرکز بسیاری از پژوهش ها بر روی ارتقاء ویژگی های Cas9 قرار گرفته است. در این راستا پیشرفت های چشم گیر در انتخاب RNA راهنما، آنزیم های جدید و روش های شناسایی هدف گیری های نابجا را می توان نام برد. در این مقاله مروری، تاریخچه و جنبه های متفاوت سیستمCRISPR/Cas9 مانند دقت در هدف گیری ژنوم، انتقال سیستم و کنترل آن بر روی رخدادهای ترمیمی همراه با کاربردهای آن در پژوهش های آتی زیست شناسی و درمان های نوین بیماری ها مورد بررسی و بحث قرار گرفته است.

برای مقابله با چالش های فعلی در کشاورزی، ویرایش ژنوم با استفاده از نوکلیازهای اختصاصی محل (SSNs) به عنوان یک ابزار قدرتمند برای تحقیقات زیست شناسی پایه و کاربردی ارایه شده است. در این مقاله، اصول و کاربرد ابزارهای ویرایش ژنوم، از جمله مگانوکلیازها (MN)، نوکلیازهای انگشت روی (ZFNs)، نوکلیازهای افکتور شبه فعال کننده ی رونویسی (TALENs) و تناوب های کوتاه پالیندروم فاصله دار منظم خوشه ای CRISPR/Cas9 توصیف می شود. در این میان؛ CRISPR/Cas9، به عنوان جدیدترین فناوری ویرایش ژنوم، به سرعت در حال توسعه است و با موفقیت در بسیاری از ارگانیسم ها مورد استفاده قرار گرفته است. این مقاله به طور خاص قدرت CRISPR/Cas9 را به عنوان ابزاری برای مهندسی ژنوم گیاهی نشان می دهد و نقاط قوت و ضعف فن آوری CRISPR/Cas9 را در مقایسه با سه ابزار ویرایش مجدد ژنوم، MNs، ZFNs و TALEN تشریح می نماید.

مهندسی هدف دار ژنوم تغییر دقیق ژنوم در بسیاری از موجودات زنده با استفاده از نوکلئازهای مهندسی شده که امروزه به عنوان یک تکنولوژی نوظهور با قابلیت و قدرت بالا مطرح شده، است. همه ابزارهای مهندسی ژنوم مبتنی بر ایجاد شکست دورشته ای (DSBs) در جایگاه هدف و سپس ترمیم متعاقب آن از طریق یکی از دو مسیر نوترکیبی همولوگ (HDR) یا اتصال انتهاهای غیرهمولوگ (NHEJ) هستند که از این طریق قادرند تا تغییرات ژنتیکی مورد نظر و دلخواه را ایجاد کنند. ابزارهای اصلی ویرایش ژنوم شامل اندونوکلئازهای انگشت روی (ZFNs)، اندونوکلئازهای افکتور شبه فعال کننده رونویسی (TALENs) و سیستم کریسپرکاس/Crispr)Cas9)هستند. این قبیل ابزارها با ایجاد تغییرات دقیق در اطلاعات ژنتیکی برای اهداف مختلف، تحول بزرگی را در علوم مختلف به خصوص پزشکی، تحقیقات بیولوژیک و بیوتکنولوژی ایجاد نموده اند. بهبود بیماری نقص ایمنی اکتسابی (AIDS) از طریق تخریب ژن CCR5 با میانجی گری ZFN یکی از مثال های شاخص به منظور نشان دادن قابلیت بالای ZFNs در ویرایش ژنوم است. تغییر ژنوم در موجودات زنده غیرمدل با پیدایش TALENs در سال 2010 امکان پذیر شد. سپس در سال 2013، سیستم CRISPR/Cas9 باعث شد تا دوره جدیدی از تحقیقات مربوط به ویرایش ژنوم آغاز شود، به طوری که از آن به عنوان انقلابی در بیولوژی یاد می شود. همچنین به زودی ویرایش ژنوم امکان درمان بیماری های ژنتیکی را نیز فراهم خواهد آورد. چشم انداز ویرایش ژنوم در تولید محصولات و دام های با ویژگی های مفید نیز امید بخش است. به عنوان مثال می توان به تولید قارچ خوراکی مقاوم به قهوه ای شدن اشاره نمود، که این محصول با غیرفعال کردن ژن های کدکننده پلی فنول اکسیداز تولید شده است. تولید کلزا و برنج مقاوم به علفکش با سیستم CRISPR/Cas9 نیز از این موارد است. این قبیل محصولات تحت عنوان محصول ویرایش شده ای که تراریخته (GMOs) نیستند، شناخته شده اند. در این مرور به ابزارهای اصلی ویرایش ژنوم، خلاصه ای از کاربرد آنها در بهبود محصولات زراعی و نسل آینده اصلاح گیاهان زراعی و منابع اصلی محاسباتی آنها پرداخته خواهد شد.

امروزه تغییر رنگ گل به دلیل اهمیت تجاری آن یکی از اهداف محققان است. با ایجاد تنوع در رنگ گلبرگ گیاهان زینتی می توان درآمدزایی بالایی برای کشور ایجاد کرد و راه را برای صادرات آن به سایر نقاط دنیا هموار کرد. در گذشته به روش سنتی و مهندسی ژنتیک تلاش هایی در راستای تغییر رنگ صورت گرفته است، اما با کندی همراه بوده است. با کشف سیستم کریسپر امکان ایجاد تغییرات هدفمند در سطح ژنوم سرعت بیشتری بخود گرفت. برای ایجاد تغییر بوسیله ی کریسپر باید ژن مورد نظر و ناحیه هدف شناسایی شود که اینکار بوسیله ی ابزار بیوانفورماتیک قابل انجام است. تغییر مورد نظر از طریق طراحی gRNA اعمال می شود. در ادامه پروتئین طبیعی و پروتئین جهش یافته عملکردشان بررسی خواهد شد. امروزه به منظور افزایش کارایی سیستم کریسپر از روش donor DNA استفاده می شود. در این سیستم با عمل نوترکیبی همولوگ می توان کارایی کریسپر را در راستای جایگزینی ژن سالم و یا خاموشی آن افزایش داد و از ایجاد تغییرات غیر اختصاصی در ژنوم جلوگیری کرد.

ژن درمانی شامل ورود ژن های اختصاصی و عملکردی به درون سلول ها با هدف پیشگیری و درمان است. این فرایند ممکن است به صورت خارج بدنی (آزمایشگاهی) یا به صورت مستقیم از طریق داخل بدنی انجام شود. یکی از روش های نوین ژن درمانی و ویرایش ژنوم که در چند سال اخیر معرفی شده و در حوزه ی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری تحولات بزرگی ایجاد کرده، سیستم ویرایش ژنی CRISPR-Cas است. این سیستم سریع تر و ارزان تر و دقیق تر از شیوه های رایج ویرایش ژن مانند روش های TALENو ZFNs است. در ارتباط با سیستم ویرایش ژنی، همانند هر فرایند نوظهور دیگری، چالش های اخلاقی و نگرانی هایی مطرح شده است؛ برای مثال، می توان از به کارگیری احتمالی این تکنیک برای اهداف هنجارشکن مانند بیوتروریسم، جهش های زیان بار وارده به موجود زنده، به هم خوردن تعادل اکولوژیک نام برد. در مقاله ی مروری حاضر، از پایگاه داده های Science Direct، Pub-Med، SID، Scopus و Web of Science استفاده و پس از انتخاب و مطالعه ی کامل مقالات مورد نیاز، اطلاعات لازم استخراج و خلاصه شد. با توجه به ملاحظات اخلاقی و حقوقی موجود در خصوص فرایندهای ژن درمانی، انتظار می رود شرایط مناسبی برای بهره گیری هرچه بهتر از ژن درمانی فراهم آمده و از نگرانی ها، لغزش های ممکن و سوءاستفاده های احتمالی کاسته شود. مقاله ی حاضر مباحث اخلاقی پیرامون ویرایش ژنوم و ژن درمانی را با تاکید بر سیستم CRISPR-Cas شرح می دهد.

سیستم تناوب های کوتاه پالیندروم فاصله دار منظم خوشه ای Cas9 (CRISPR/Cas9) یکی از روش های موثر و جدید ویرایش هدفمند ژنوم است که در جهت ارتقای کیفیت و عملکرد گیاهان زراعی و ایجاد صفات جدید گیاهی مورد استفاده است. سازوکار CRISPR/Cas9 بطور گسترده در ویرایش ژنوم، خاموشی ژن، کنترل فرآیند رونویسی همراه با اختصاصیت بالا و کاهش اثرات توالی های غیرهدف توسط برش های دورشته ای (DSBs) در DNA ژنومی و تغییر در توالی نوکلئوتیدی ژن هدف در بسیاری از سیستم های گونه های متنوع گیاهی و جانوری توسعه یافته است. در این مقاله مروری، جنبه های وسیع کاربرد سیستم CRISPR/Cas9 در ویرایش هدفمند ژنوم جهت توسعه گیاهان ویرایش ژنتیکی شده، دستیابی به تطابق محیطی و کشاورزی بیوانرژیک و ملاحظات زیست محیطی و مقبولیت جوامع بشری این سیستم را به اجمال مرور می شود. توسعه گیاهان زراعی ویرایش ژنتیکی (GE) به طور کامل مشابه با گیاهان زراعی اصلاحی معمول نشاندهنده کارآمدی و پایداری این محصولات در شرایط مختلف آب وهوایی بوده، از نظر پذیرش اجتماعی، ملاحظات زیست محیطی و سلامت انسان ترایخته در روند آزادسازی در اولویت مصرف هستند.

1مقدمه: سیستم CRISPR/Cas، سیستم ایمنی اکتسابی باکتری­ها در مقابله با عوامل مهاجم خارجی است. پروتئین Cas9 باکتری استرپتوکوکوس پیوژنز، رایج­ترین پروتئین Cas استفاده شده در ویرایش ژنوم می­باشد؛ اما پروتئین­های Cas9 دارای مشکلاتی مانند وقوع جهش­های نابه جا هستند که مانعی مهم در مسیر به کارگیری آن­ها برای مقاصد درمانی می­باشد. هدف از این مطالعه، طراحی یوانفورماتیکی یک پروتئین Cas9 جهش یافته به منظور افزایش دقت آنزیم در امر ویرایش ژنوم است.   روش: در این مطالعه ابتدا با انتخاب برخی از جهش­ها و اعمال آن در پروتئین، Cas9 جدید به صورت in silico طراحی شد. با روش داکینگ مولکولی نحوه اتصال spCas9 جهش یافته و وحشی به DNA مورد بررسی قرار گرفت. در آخر، پایداری دو پروتئین جهش یافته و وحشی با استفاده از دینامیک مولکولی مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج: نتایج این مطالعه منجر به طراحی یک پروتئین جهش یافته با 5 جهش شد. نتایج داکینگ مولکولی امتیاز 1073/86-را برای پروتئین تیپ وحشی و امتیاز 349/41-را برای پروتئین جهش یافته نشان داد. نتیجه گیری: بررسی داکینگ مولکولی نشان داد که از پیوندهای بین پروتئین و DNA در حالت جهش یافته کاسته شده است. همچنین، نتایج دینامیک مولکولی نشان داد که پایداری دو پروتئین جهش یافته و تیپ وحشی مشابه یکدیگر می باشند.

زمینه و هدف: مهندسی هدف دار ژنوم (genome targeting engineering)، یکی از مهم ترین پیشرفت های مهندسی ژنتیک در هزاره سوم است. اساس این فرایند در عملکرد اندونوکلئازهای مهندسی شده نهفته است. این ابزارها از طریق ایجاد برش های دو رشته ای در یک ناحیه شناخته شده از ژنوم و به دنبال آن ترمیم این برش ها توسط سازوکارهای نوترکیبی هومولوگ (Homologous Recombination) یا اتصال انتهاهای غیرهومولوگ (Non-Homologous End Joining)، می توان تغییرات ژنتیکی مورد نظر را ایجاد کرد. اندونوکلئاز های ویرایش کننده ژنوم، از توانایی بالایی در راستای فهم عملکرد ژن و کاربردهای ژن درمانی برخوردارند. مگانوکلئازها (Meganucleases)، اولین رده از این ابزارهایند که به طور طبیعی در همه قلمروهای حیات یافته شده و نقش مهمی را در مهندسی هدف دار ژنوم ایفا کرده اند. دومین رده، نوکلئازهای انگشت روی [Zinc Finger Nucleases (ZFNs)] هستند که از یک سری قلمرو انگشت روی شناسایی کننده DNA ادغام شده با قلمرو کاتالیتیک آنزیم FokI ساخته شده اند. رده دیگر نوکلئازهای افکتور شبه فعال کننده رونویسی [Transcription Activated-Like Effector Nucleases (TALENs)] می باشند که قلمرو های شناسایی کننده DNA از باکتری بیماری زای گیاهی از جنس گزانتوموناس (Xnathomonas) مشتق شده اند و مانند رده دوم با قلمرو کاتالیتیک FokI ادغام می شوند. آخرین رده اندونوکلئازهای مهندسی شده، برگرفته از سیستم ایمنی اکتسابی باکتریایی است که Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR-associated (CRISPR/ Cas)] نامیده می شوند. در این سیستم اندونوکلئاز Cas9 توسط یک RNA راهنما که با DNA هدف جفت می شود به توالی موردنظر فراخوانده شده و سپس DNA توسط زیرواحدهای آنزیم برش می خورد. در این مقاله، با استفاده از تجربیات شخصی و بهره گیری از ده ها منبع معتبر و روزآمد، ویژگی های چهار رده اندونوکلئاز مطرح شده در بالا، و پیشرفت های انجام گرفته برای افزایش کارایی و ویژگی آن ها در پژوهش های پایه ای و کاربردی مورد بررسی و بحث قرار گرفته است.